Nature aging：鐵穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞克隆性驅(qū)動(dòng)衰老中癌癥相關(guān)的腸道DNA甲基化漂變

一、研究背景

表觀遺傳漂變是衰老的核心特征之一，表現(xiàn)為基因組DNA甲基化模式隨時(shí)間的漸進(jìn)性改變。這種變化具有組織特異性，并與癌癥等多種年齡相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。研究表明，衰老組織常出現(xiàn)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常高甲基化，而結(jié)直腸癌中此類表現(xiàn)尤為突出，例如Wnt通路拮抗劑DKK、SFRP基因家族常因DNA高甲基化而沉默。

近年來，表觀遺傳時(shí)鐘的建立證實(shí)了DNA甲基化變化與生理年齡之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)，且癌癥組織常呈現(xiàn)顯著的表觀遺傳年齡加速。然而，驅(qū)動(dòng)衰老相關(guān)DNA甲基化漂變的具體分子機(jī)制，特別是其如何在正常組織中起源、積累并最終促進(jìn)腫瘤發(fā)生，仍不明確。與此同時(shí)，腸道干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的上皮高速更新、隱窩的克隆性擴(kuò)張及分裂等組織特性，為研究年齡依賴性表觀遺傳變化的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)提供了獨(dú)特模型。

現(xiàn)有證據(jù)提示，表觀遺傳漂變可能是連接衰老、組織穩(wěn)態(tài)失衡與癌癥早期事件的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，闡明其細(xì)胞起源、擴(kuò)張規(guī)律及上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于理解衰老相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。

二、研究目的

本研究旨在系統(tǒng)揭示衰老與結(jié)直腸癌中腸道特異性DNA甲基化漂變的起源、擴(kuò)張機(jī)制及其生物學(xué)意義。具體目標(biāo)包括：首先，在人類和小鼠模型中鑒定并表征一種在衰老腸道和結(jié)腸癌中普遍存在的啟動(dòng)子高甲基化模式，即ACCA漂變。其次，探究該漂變的細(xì)胞起源，明確其是否起始于腸道干細(xì)胞并在分化過程中得以維持。第三，解析漂變?cè)诮M織中的擴(kuò)張動(dòng)力學(xué)，闡明隱窩克隆性與分裂在其中扮演的關(guān)鍵角色。第四，從分子機(jī)制層面揭示上游驅(qū)動(dòng)因素，重點(diǎn)探究衰老相關(guān)的炎癥微環(huán)境、Wnt信號(hào)減弱如何通過擾亂腸道上皮細(xì)胞的鐵代謝穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而損害TET酶活性，最終導(dǎo)致特定基因啟動(dòng)子異常高甲基化的完整通路。最終，評(píng)估該漂變對(duì)細(xì)胞功能及腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，并探索通過糾正鐵代謝或Wnt信號(hào)來逆轉(zhuǎn)這一衰老相關(guān)表觀遺傳異常的潛在干預(yù)策略。

三、研究方法

本研究采用跨物種、多層次整合策略，結(jié)合生物信息學(xué)分析、小鼠模型及分子生物學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)探究腸道DNA甲基化漂變。

1. 人類隊(duì)列分析： 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的健康與結(jié)腸癌樣本，進(jìn)行全基因組甲基化（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)分析，通過主成分分析、差異甲基化分析和基因富集分析，鑒定衰老與癌癥共有的ACCA甲基化漂變特征。

2. 小鼠機(jī)制驗(yàn)證：

模型構(gòu)建： 使用年輕與老年小鼠，分離腸道隱窩及Lgr5+腸道干細(xì)胞，進(jìn)行簡(jiǎn)化代表性（RRBS）或全基因組（WGBS）甲基化測(cè)序，驗(yàn)證ACCA漂變的保守性。

類器官培養(yǎng)： 建立腸道類器官模型，通過改變培養(yǎng)條件（生長(zhǎng)因子濃度、葡萄糖、鐵螯合劑、TET抑制劑、Wnt激活劑等），在體外模擬并操縱衰老微環(huán)境，探明細(xì)胞增殖、Wnt信號(hào)與鐵代謝對(duì)漂變的影響。

單隱窩分辨率分析： 創(chuàng)新性地結(jié)合激光捕獲顯微切割（LCM） 與焦磷酸測(cè)序，實(shí)現(xiàn)單個(gè)腸道隱窩的DNA甲基化定量，用于評(píng)估漂變的異質(zhì)性、克隆性及通過隱窩分裂擴(kuò)張的動(dòng)力學(xué)。

譜系追蹤： 利用Confetti多色熒光報(bào)告小鼠，在體觀察并分離相同克隆來源的隱窩，直接證實(shí)DNA甲基化漂變?cè)陔[窩分裂中的遺傳與正向選擇。

3. 分子機(jī)制解析： 通過蛋白質(zhì)印跡、酶活性測(cè)定、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、5hmC免疫沉淀（hMeDIP）及基因敲除/過表達(dá)模型（如Tet2/3-dKO小鼠），系統(tǒng)驗(yàn)證了“炎癥/Wnt信號(hào)減弱 → 鐵代謝紊亂（TfR1↓/FPN1↑）→ 細(xì)胞內(nèi)Fe2?減少 → TET2/3酶活性受損 → 靶基因啟動(dòng)子高甲基化"的核心通路。

四、主要研究結(jié)果

1、結(jié)腸癌與表觀遺傳漂變的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中人類結(jié)腸樣本的DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，健康腸道組織的DNA甲基化模式隨年齡增長(zhǎng)呈現(xiàn)系統(tǒng)性漂變，而結(jié)腸癌組織的漂變程度更強(qiáng)且與年輕組織方向一致。這種衰老與結(jié)腸癌共有的甲基化漂變（ACCA漂變）特征性地表現(xiàn)為特定基因啟動(dòng)子的高甲基化，其中63%在衰老和癌變中重疊?；蚬δ芊治鲲@示，這些基因富集于Wnt信號(hào)通路等干細(xì)胞相關(guān)通路。值得關(guān)注的是，這種漂變模式不僅存在于結(jié)腸癌，在食管癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌中也顯著富集，提示其可能反映整個(gè)消化系統(tǒng)的衰老相關(guān)變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，近半數(shù)ACCA漂變基因在癌組織中表達(dá)下調(diào)，表明該表觀遺傳改變可能導(dǎo)致基因功能沉默。

圖1、結(jié)腸癌與表觀遺傳漂變的細(xì)胞相關(guān)聯(lián)

2、ACCA漂變?cè)谛∈竽c道中保守，起源于干細(xì)胞且不依賴細(xì)胞周期

研究證實(shí)ACCA漂變?cè)谛∈笏ダ线^程中保守存在，腸道隱窩全基因組甲基化分析顯示CpG島高甲基化隨年齡增加而增強(qiáng)。通過分離Lgr5+腸道干細(xì)胞進(jìn)行深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該漂變?cè)诟杉?xì)胞層面就已確立，并且在整個(gè)隱窩細(xì)胞群中得以維持。利用腸道類器官模型的研究表明，ACCA漂變具有細(xì)胞固有性，體外培養(yǎng)后仍能保留。更重要的是，通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子降低細(xì)胞增殖速率并不會(huì)減弱漂變程度，反而在低增殖條件下有所增強(qiáng)，表明該漂變不依賴于細(xì)胞分裂。然而，激活Wnt信號(hào)通路可顯著降低漂變程度，揭示Wnt信號(hào)減弱是關(guān)鍵的驅(qū)動(dòng)因素。

圖2、ACCA漂變?cè)谛∈竽c道中保守，起源于干細(xì)胞水平且不依賴細(xì)胞周期

3、DNA甲基化漂變通過隱窩克隆性傳播，在CpG水平具有異質(zhì)性

采用單隱窩分辨率分析技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠腸道隱窩的DNA甲基化水平呈現(xiàn)三峰分布：wan全未甲基化、單等位基因甲基化和雙等位基因甲基化，這種分布與單克隆起源特征相符。盡管在單個(gè)CpG位點(diǎn)水平上漂變模式表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，但在整個(gè)基因啟動(dòng)子水平上變化趨勢(shì)保持一致性。對(duì)多個(gè)基因啟動(dòng)子的綜合分析顯示，老年隱窩傾向于"全有或全無"的甲基化模式，要么多個(gè)基因均甲基化，要么均不甲基化，表明DNA甲基化漂變以模塊化方式在克隆內(nèi)同步積累。這些發(fā)現(xiàn)揭示了雖然漂變?cè)谖⒂^層面具有隨機(jī)性，但在功能層面卻表現(xiàn)出系統(tǒng)性。

圖3、 DNA甲基化漂變通過隱窩克隆性傳播并在CpG水平表現(xiàn)出異質(zhì)性

4、DNA甲基化漂變通過隱窩分裂擴(kuò)張并被正向選擇

通過對(duì)相鄰隱窩進(jìn)行DNA甲基化圖譜分析，發(fā)現(xiàn)地理位置相鄰的隱窩具有高度相似的甲基化模式，支持漂變通過隱窩分裂機(jī)制進(jìn)行克隆性擴(kuò)張。利用Confetti多色熒光報(bào)告小鼠模型進(jìn)行的譜系追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)過一年時(shí)間，同一克隆來源的隱窩更傾向于形成空間聚集的"斑塊"。重要的是，這些聚集隱窩的DNA甲基化水平顯著高于散在分布的同克隆隱窩，表明攜帶高甲基化漂變的隱窩克隆在組織穩(wěn)態(tài)中具有選擇性優(yōu)勢(shì)。這種正向選擇機(jī)制導(dǎo)致高甲基化漂變?cè)谀c道組織中逐漸積累并擴(kuò)大影響范圍。

圖4、 DNA甲基化漂變通過隱窩分裂擴(kuò)張

5、高DNA甲基化漂變的隱窩存在鐵代謝紊亂與TET酶活性受損

對(duì)高甲基化和低甲基化單隱窩進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，高漂變隱窩的鐵代謝通路發(fā)生顯著改變：鐵攝入蛋白TfR1表達(dá)下調(diào)，而鐵輸出蛋白FPN1表達(dá)上調(diào)。這種改變導(dǎo)致老年小鼠隱窩細(xì)胞內(nèi)Fe2?水平顯著下降。由于Fe2?是TET雙加氧酶家族的關(guān)鍵輔因子，其濃度降低直接導(dǎo)致TET酶活性顯著受損，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性保持不變。功能實(shí)驗(yàn)表明，通過藥物抑制TET活性或使用Tet2/3雙敲除小鼠模型，均能直接誘導(dǎo)靶基因啟動(dòng)子高甲基化；同樣，使用鐵螯合劑降低細(xì)胞內(nèi)鐵水平也能重現(xiàn)ACCA漂變表型。

6、恢復(fù)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或激活Wnt通路可挽救鐵穩(wěn)態(tài)并抵抗DNA甲基化漂變

機(jī)制干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，在老年小鼠來源的腸道類器官中重新表達(dá)TfR1，能夠恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)、提升TET酶活性，并降低靶基因啟動(dòng)子的甲基化水平。同時(shí)，激活Wnt信號(hào)通路（通過添加Wnt3a或CHIR99021）也能上調(diào)TfR1表達(dá)、改善鐵代謝并增強(qiáng)TET活性。當(dāng)面對(duì)炎癥因子IFNγ的挑戰(zhàn)時(shí)，腸道細(xì)胞出現(xiàn)鐵代謝紊亂和TET活性抑制，但共同激活Wnt通路可有效逆轉(zhuǎn)這些負(fù)面效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向鐵代謝或Wnt信號(hào)通路可能成為干預(yù)衰老相關(guān)表觀遺傳漂變的潛在策略，為預(yù)防年齡相關(guān)的腸道疾病提供了新思路。

圖6、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體恢復(fù)以及Wnt通路刺激可挽救鐵穩(wěn)態(tài)

五、創(chuàng)新與不足之處

研究在多個(gè)維度深化了對(duì)衰老相關(guān)表觀遺傳漂變的理解。首先，在機(jī)制深度上實(shí)現(xiàn)了重要突破：研究超越了現(xiàn)象描述，首ci將衰老微環(huán)境、細(xì)胞代謝與表觀遺傳調(diào)控在分子層面直接串聯(lián)。它精準(zhǔn)揭示了“炎癥/Wnt信號(hào)減弱 → 鐵代謝穩(wěn)態(tài)失衡 → TET酶輔因子缺乏 → 活性受損 → 靶基因特異性高甲基化"這一清晰且完整的因果鏈條，為理解衰老如何通過代謝重編程驅(qū)動(dòng)表觀遺傳紊亂提供了全新范式。其次，在研究尺度和技術(shù)整合上獨(dú)ju匠xin：創(chuàng)新地將單隱窩水平的高分辨率DNA甲基化分析與活體譜系追蹤技術(shù)（Confetti小鼠模型）相結(jié)合，在單克隆水平上直觀“看到"了表觀遺傳漂變通過隱窩分裂進(jìn)行傳播和擴(kuò)張的動(dòng)態(tài)過程，并令人信服地證明了該漂變克隆在組織穩(wěn)態(tài)中受到正向選擇。這種時(shí)空動(dòng)力學(xué)解析將表觀遺傳變化與干細(xì)胞群體行為緊密聯(lián)系，為理解衰老組織中克隆動(dòng)態(tài)提供了新視角。此外，研究充分利用類器官模型的可操縱性，系統(tǒng)模擬并驗(yàn)證了各節(jié)點(diǎn)間的調(diào)控關(guān)系，展示了強(qiáng)大的機(jī)制探究能力。

研究雖機(jī)制闡釋深入，但仍存在若干局限。首先，臨床驗(yàn)證不足，核心機(jī)制主要在小鼠模型確立，其在人類衰老及癌變組織中的普適性、核心地位及可干預(yù)性仍需在人類類器官和臨床樣本中驗(yàn)證。其次，功能探索有限，研究側(cè)重于ACCA漂變與癌癥風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，但對(duì)其是否直接損害腸道生理功能（如屏障、吸收），以及數(shù)百個(gè)漂變基因的協(xié)同效應(yīng)缺乏深入解析。最后，系統(tǒng)性視角缺失，研究聚焦細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制，未探討全身性衰老因素（如循環(huán)因子、菌群）如何與該局部通路交互作用，從而影響漂變進(jìn)程。

六、研究總結(jié)

本研究系統(tǒng)闡明了衰老及結(jié)腸癌中腸道特異性DNA甲基化漂變（ACCA漂變）的核心機(jī)制。ACCA漂變是一種源于腸道干細(xì)胞的細(xì)胞固有性表觀遺傳改變，通過隱窩克隆分裂在組織中傳播與富集。其上游驅(qū)動(dòng)機(jī)制為：衰老相關(guān)的炎癥與Wnt信號(hào)減弱引發(fā)腸道上皮細(xì)胞鐵代謝紊亂（TfR1↓/FPN1↑），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Fe2?匱乏，進(jìn)而損害以Fe2?為輔因子的TET2/3酶活性，最終致使DKK、SFRP等Wnt通路拮抗基因啟動(dòng)子發(fā)生異常高甲基化。該漂變可能通過沉默關(guān)鍵抑癌通路破壞組織穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)TfR1表達(dá)或激活Wnt信號(hào)可逆轉(zhuǎn)這一表觀遺傳異常，為干預(yù)年齡相關(guān)性腸道疾病提供了潛在新策略。